规模化酵母双杂交技术
-细胞信号通路中药物基因靶标筛选的技术平台

人体内相当一部分基因参与细胞信号转导活动。 细胞内的信号传递通路是通过从细胞膜到细胞核之间的蛋白之间的相互作用实现的。很多疾病，如在肿瘤坏死因子（TNF）导致的炎症反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之间的相互作用，最终激活NF-kB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路中的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到疾病治疗目的。如果能将信号传递通路中的可阻断部分全部鉴定出来，研究人员就可迅速发现新的基因靶标，找到阻断如肿瘤坏死因子等信号传递通路的办法。例如，美国最著名的生物科技公司之一，Tularik，就使用酵母双杂交系统在肿瘤坏死因子通路上发现了IkB磷酸化酶基因靶标，抑制这一酶的活性可以阻止IkB的降解，从而抑制NF-kB的激活，阻断TNF引起的炎症反应。可见，基因靶点的发现和功能验证是开发小分子化学药物的必经途径。

尽管人类有大于30,000个基因，但只有大约5,000个基因可以用来作药物靶点，其中磷酸激酶，磷酸酶和蛋白酶等几类蛋白序列有很大保守性，是公认的药物筛选基因靶点，这就为我们的功能基因组计划缩小了首选基因的范围。

为此，我们优先选择的靶基因是：磷酸激酶、磷酸酶和蛋白酶与部分受体等。优先目标是鉴定上述靶基因在以下几个疾病相关信号通路中的作用：① 与癌症相关的细胞周期调控；② 与癌症和中风相关的细胞凋亡；③ 关于炎症中TNF，CD40和IL1信号传递通路；④ 与自身免疫和器官移植相关的TCR 和BCR信号传递途径。

目前，我们正采用酵母双杂交系统进行规模筛选，与此相关的技术已经建立，并在方法上赋予了以下新内容：① 建立包括细胞周期调控，细胞凋亡，致癌基因，炎症信号通路，淋巴细胞受体信号通路等通路上的所有已知基因的全长cDNA文库。② 作为诱饵的基因，将使用从GeneBank中的EST序列合成的、没有任何功能注释或加注不完全的所谓新基因。③ 使用酵母交配的方法在96孔板中进行筛选。④ 在阳性克隆被鉴定后，使用生物信息学统计的方法进行筛滤，将高结合力蛋白有效地筛选出来。⑤ 哺乳动物细胞验证蛋白相互作用的真实性。由于此技术平台刚刚建立，整个过程正在逐步完善，我们下一步目标是进行快速、低耗的规模化酵母双杂筛选的试验。预计在癌症、中风、炎症、免疫等四类疾病的信号传递通路中鉴定出可供药物筛选的靶点位置，为疾病诊治提供有用信息。