第三代测序技术是指单分子测序技术,在测序过程中不需要经过PCR扩增,实现对每一条DNA分子的单独测序。三代测序技术具有反应速度快、超长读长,无模板扩增、直接检测表观修饰位点、测序错误随机出现,没有GC或修饰的偏好性等特点。诺赛基因主要应用的测序平台为是Pacific Biosciences (PacBio) 公司的单分子实时测序技术平台和Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的单分子纳米孔测序技术平台。这两个大平台也是目前最有代表性的三代测序平台。

三代测序
服务流程
服务内容

1) 扩增子测序

2) 全基因组测序

3) 全长转录组测序

4) 甲基化测序(具体项目请先咨询)

测序技术特点

1)单分子测序,大大提高了样本的通量和检测的速度;

2)RNA直接测序,大大降低了体外逆转录产生的系统误差;

3)长片段测序,大大提高DNA聚合酶内在自身的延续性(延续性,也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段)

订购信息

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平台介绍

PacBio Sequel 测序平台

随着测序技术的不断推进,以PacBio为代表的第三代基因测序技术逐渐应用到多个科研领域。该平台是美国太平洋生物技术公司(Pacific Biosciences)基于纳米小孔的单分子读取技术,又称作单分子实时测序技术SMRT,Single Molecule Real-Time),无需扩增即可快速完成序列读取。

PacBio Sequel测序仪是201510月推出全新升级的第三代测序平台,该系统较上一代RSII平台测序体积减少2/3、通量提高7倍、单Gb数据成本更低、测序周期更短。2019年4月,该公司重磅发布新一代测序系统PacBio SequelⅡ,与PacBio Sequel测序系统相比,PacBio SequelⅡ芯片支持8M SMRT Cell ,单张芯片测序通量提升了8倍,并可产出高精准度的长读长HiFi reads,碱基准确度可达99.9% 以上,具有测序通量更高、耗时更短、准确度更高、应用更灵活等特点。

技术原理

SMRT技术应用了边合成边测序的思想,将测序文库、DNA聚合酶以及四色荧光基团标记的dNTP放置在ZMW孔(即零模波导孔Zero-Mode Waveguides)底部,进行单个DNA分子的合成反应。在测序过程中,以SMRT芯片为测序载体,以共价结合方式固定的DNA聚合酶和测序模板相结合,根据模板链核苷酸顺序,对应的dNTP加入发生链延伸反应,通过检测4种dNTP的荧光信号,以及荧光的波长与峰值分析获得DNA的碱基序列。

平台优势

平均读长10-15Kb,最长可达40-70Kb,通量~80 Gb/cell,较二代测序平台读长更长,有效解决短序列数据的拼接难题,且时间更短;在极端高GC和极端低GC区域,可以轻松测定,从而保证序列覆盖的完整性和均一性。建库过程中,DNA不需要进行PCR扩增,避免了覆盖度不均一和PCR冗余。

应用领域

1)全基因组de novo测序

2)基因组草图的优化或基因组完成图绘制

3)全长转录本测序

4)宏基因组测序

5)16S rDNA全长测序

6)细胞器基因组测序

7)全基因组重测序&稀有变异鉴定

8)表观遗传学

Pacbio测序实验流程

1)高质量总RNA(DNA)的制备;

2)SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech)反转录,将 RNA 反转录成 cDNA并加接头序列(DNA直接加接头);

3)文库构建(即环化);

4)上机测序。

Nanopore测序平台

Nanopore平台是牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,简称ONT)研发的新兴实时单分子纳米孔测序技术平台。用于Nanopore平台测序的DNA或RNA建库过程简单直接,最快的建库方法只需5到10分钟就可在样本分子末端添加测序接头及马达蛋白。具有测序通量更高、耗时更短、准确度更高、应用更灵活等特点。所有Oxford Nanopore测序设备使用同样的核心技术,用户可以轻松根据应用测试实验以及扩大或缩小规模。从最小型的Flongle和掌上MinION,到桌面型的GridION和PromethION。所有设备都可用于进行按需测序实验。包括从单次试验到超高通量项目,全部都可提供快速、长读长、实时的DNA或RNA直接测序。

技术原理

ONT测序平台通过电信号识别碱基序列。当DNA/RNA单链通过纳米孔时,不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号,通过对这些信号检测,可获得相应碱基类型,完成测序。

1.   解螺旋,将双链DNA解开成单链;

2.   DNA单链分子通过一个孔道蛋白,孔道中有个充当转换器的蛋白分子;

3. 进入纳米孔的单分子引起特征性的电流干扰,不同的DNA单分子停留在孔道中就会形成特征性离子电流变化信号, 带来电流不同的变化;

4.不同的碱基带来的电流变化是不同的, 转化器蛋白分子可以感受每个碱基的电流变化。

5.  根据电流变化的频谱,应用模式识别算法得到碱基序列。

平台优势

理论读长无限长,试剂读长受样品的实际文库长度限制DNA/RNA直接测序,目前报到处DNA片段长度最高记录为>2 Mb,直接RNA测序读长最长为26kb,MinION通量为20Gb/cell,GridION X5 通量为50-100Gb/cell,PromethION通量为Tb级;文库制备简单快速,10 分钟文库制备;多种型号可选择,扩增性更强;MinION较Pacbio测序平台体积小,更便协调、易操作;结构变异的检测更有优势;可对RNA进行表达分析。

应用领域

1)全基因组de novo测序

2)基因组草图的优化或基因组完成图绘制

3)全长转录本测序

4)宏基因组测序

5)16S rDNA全长测序

6)细胞器基因组测序

7)全基因组重测序&稀有变异鉴定

8)表观遗传学

Nanopore测序实验流程:

1)高质量总DNA提取;

2)建库主要是需要给待测DNA两侧先加上A碱基,使平末端变成黏性末端,然后再加上Y接头以及马达蛋白;

3)上机测序。

测序方案

MinION:

无需等待的即时测序

能在实验室外进行实地测序

达到每48 小时10-20 Gb数据量

​MinIno平台 

特点:袖珍型、便携式生物分析设备                  

多达 512 个纳米孔通道                                  

样本制备只需10 分钟,简单快捷                       

实时分析,工作流程快速高效

适用于 DNA 或 RNA 直接测序

GridION X5:

从事较大的测序项目, 有5 个 MinION 测序芯片(每 48 小时 50-100Gb 数据量)

直接在测序仪上进行碱基序列读取——无需辅助设施。

PromethION:(暂不提供此平台的服务)

具有庞大数据量的项目 (Tb) 

能对大量样本进行按需测序服务

高通量、高样本数的台式系统

模块化设计:多达 48 个测序芯片,各有多达 3,000 个纳米 孔通道(总计达 144,000 个)

测序芯片既可单独也可同时运行

应用于大容量样品测序,工作流程与 MinION相同

1. PacBioSequel测序平台建库的注意事项?

利用PacBio Sequel进行全长转录组测序,平台包含16个测序模块(SMRT cell),每个SMRT cell包含100万个零模波导孔(每个零模波导孔为1个测序单元,完成1条DNA分子的测序反应)。需要将 mRNA 进行反转录并进行环化处理,形成 CCS,每个零模波导孔将容纳 1个CCS分子。由于全长转录组测序对mRNA不进行打断,直接进行上机测序,而每个CCS的片段长度不同,较小的CCS会先落入ZMWs中,而导致长片段很难测到。因此,在文库构建时,建议将 mRNA 根据长度分成不同的段,分别构建文库和测序。


2. 全长转录组测序分析内容包括哪些?

分析内容包括:转录本覆盖度计算、转录本功能注释、转录本GO分类注释、转录本 eggNOG分类注释、转录本KEGG分类注释、ORF分析、可变剪接分析等。


3.三代测序相比二代测序的优势有哪些?

三代测序具有长读长的特点,平均读长在10-15Kb,而二代测序的读长为PE150-250bp,所以三代测序拼接效率更高,用低覆盖度即可完成基因组组装;并且由于测序过程无需进行PCR扩增,可轻松覆盖高GC和高重复区域,对低丰度/低频突变定量更准;对基因组组装和基因组变异检测效率更高;另外,利用测序过程聚合酶反应的动力学变化,直接检测碱基修饰,可以统一分析基因组学和表观遗传学数据。


4.三代的错误率高能否用于基因组组装?

三代的错误率是随机的碱基错误率,可达15%,但随着自身覆盖度的增加就可以进行纠错,当覆盖度在30X以上时,碱基准确度达99.99%以上。所以三代数据用于基因组组装是完全没有问题的。


5.动植物基因组的样品选择?

基因组精细图的样品要尽量与调研图样品为同一个体,植物样品最好选择无污染的组培苗、嫩叶等,而动物样品最好选择全血或者内脏组织。


6. Pacbio Sequel平台的产出情况如何?

目前最新的Pacbio Sequel Ⅱ平台CLR模式单张芯片产出在100-150G之间,CCS模式产出大概在250-300G之间,具体的产出与文库质量、文库大小相关。一般de novo项目文库类型为CLR-20Kb、CLR-30Kb和CLR-40Kb,平均subreads长度在10-20Kb,subreads N50 长度在20-30Kb之间。

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