Sanger测序服务作为诺赛基因经典项目,从1998年承担国际人类基因组计划中国区1%测序任务至今,其间承接多项国家级重大项目。业务涉及生物学各领域,包括DNA测序、RNA测序、甲基化测序等服务。诺赛基因拥有世界一流的仪器设备、超过20年对外测序服务经验、标准化的测序流程、全程监控的质量保障和质量控制系统,本着“客户第一、服务至上”的企业宗旨,致力于为客户提供高质量、高性价比、高效率的测序服务。

Sanger测序
样本要求

样品类型

浓度

体积(最少量)

长度

备注

PCR原液

1ul电泳检测应为明亮的一条带

(≥20ng/ul)

≥30ul

100bp~3k

5ul/反应

已纯化PCR产物

≥10ng/ul


10ul

100bp~3k

5ul/反应

质粒

≥50ng/ul

10ul

插入<6k

5ul/反应

(当插入片段大于10K时要加大送样浓度)

菌液

甘油菌和刚接种的菌液请注明

50ul

插入<6k

只接收大肠杆菌;需注明载体和抗性,特殊抗性请自备并注明用量;对于拷贝数低和大的质粒载体,请自行提供质粒测序

引物要求

1. 建议PAGE纯化测序引物;

2. 引物浓度不低于5 pmol/ul,不少于10ul。样品较多或反应数多时需多提供,正常情况下,按1ul/个反应计算;

3. 引物长度一般在18-23bp比较适合测序,引物Tm=50~60℃,18~25mer,GC含量40~60%。无四个以上连续碱基,尤其3’端;

4. 随机引物(RAPD引物)和简并引物,混合引物以及引物长度不足17bp或大于35bp的不建议用于测序;

5. 勿使用有荧光标记或其它标记的引物;

6. 随工引物保存三个月;公司合成的引物保存一年;特殊要求请与公司联系;
服务特点
注意事项

请详细填写诺赛基因DNA测序登记单,为避免产生问题订单,大批量的样品请提供电子版测序登记单;

人员稳定:服务平台的重要岗位人员均具有多年经验有效降低实验过程中的人为误差;

样管上编号请和登记单上保持一致,样品编号可包含“字母”、“数字“—”,请勿出现其他特殊字符;

质量可靠:上下游实验均采用磁珠纯化,实验稳定结果更好;

请详细填写诺赛基因DNA测序登记单,为避免产生问题订单,大批量的样品请提供电子版测序登记单;

管理规范:通过ISO9001:2015质量管理体系认证;

需要测序的引物不是通用引物时,请单独提供,并标注浓度

快速交付质粒样品最快8小时出具结果,且有完善的LIMS系统,可以实时跟进实验进度以及结果的在线下载;

测序样品存在特殊结构,请在订单上备注,如:GC rich大于70%、甲基化、复杂结构等;

测序通量:拥有多台3730xl测序仪,可满足大批量测序要求;

测序结果说明

1. 接收样品当天不计算在内,12-48小时内发送测序结果;

2. 测序结果我们以压缩文件Zip形式发送,内含测序结果和《DNA测序报告》,其中:

A.ab1为后缀的文件为测序图谱,可使用CHROMAS, BIOEDIT, DNAMAN 等软件打开;

B. Seq为后缀的文件为碱基序列,可使用NOTEPAD(记事本)或者DNAStar等软件打开;

C.《DNA测序报告》为HTML文件,可使用Internet Explorer等网络浏览器打开,该报告包含样品测序的详细信息,同时作为我公司与您对测序服务交流的重要书面材料,请认真查看;

3. 如需对您的样品测序进行实时跟踪和结果下载, 请登录http://61.49.28.136/web, 输入用户名和密码,即可进入页面进行测序跟踪和结果下载;

4. 典型的峰图;

订购信息

1.E-mail:测序部dnaseq@vip.163.com

2.电话订购:010-67873039/4478,010-67868644;万经理:13810506625;李经理:13522520637;

3.QQ咨询:——————;

4.相关资料:诺赛基因DNA测序登记单

                       诺赛基因96DNA测序登记单

                       诺赛基因通用引物表;

1.为什么过短的PCR产物不适于直接测序?

首先,测序的引物是没有荧光标记的,所以我们测的序列是从引物后面的碱基开始的,同时由于引物后面3050bp碱基测序不准确,考虑到后续有效序列比对的问题,所以建议用于测序的PCR产物的长度一般不低于150bp;其次,过短的PCR产物纯化比较困难,所以建议PCR产物片段不低于150bp;再次,太短的PCR产物测序受外界的干扰比较大,很容易造成测序失败或不理想;综上所述,我们建议用于测序的PCR产物的长度一般不低于150bp。如低于150bp建议您重新设计扩增引物或是克隆后再测序。


2.DNA片段很长,一个反应测不到头,怎么办?

可以分别用两端引物进行双向测序,让其中间部分的序列交叉互补,便可完全测通。如果这样还测不通,可在已经测出序列的500~700个碱基处设计测序引物做进一步测序(即Primer Walking),直至完全测


3.为什么在primer walking时总将引物设计得那么靠前?

我们在设计引物时有两个准则。一是用于设计引物的序列必须准确,二是在引物区之后还必须有足够的准确序列用于拼接。这样我们设计引物的位置就必然在已测序的准确序列的末尾之前一段位置上,在满足软件设定的条件下,我们总会选取最靠近3’端的引物来作为最终的测序引物。


4.我有一个4KB的PCR片段,希望你们帮我测通。

大于3KB的PCR片段要测通最好是构建到载体上再进行测序。这样模板更加稳定,测序效果也更好一些。


5.PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?

众所周知,PCR扩增过程中会出现错配现象,但所有错配都发生在同一位置的概率极低。PCR片段直接测序时,测得的是PCR产物众多分子混合物的结果。若某一个位点上极少的一些PCR产物(约几十个分子)在该位点上存在错配,但大多PCR产物(约几十万个分子)在这个位点上还是正确的,因此测序时,错配现象是反映不出来的。而PCR片段经克隆后测序是测定某一个PCR产物分子的DNA序列。在几十轮循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何位点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时选用保真性能高的DNA聚合酶。


 6.我测得的基因序列为什么与标准序列有差别?

原因可能是:

①PCR扩增过程中产生错误;

②载体扩增或保存过程中发生突变;

③ABI公司承诺其仪器的测序精度是≧98.5%。

解决措施有:

①排除模板、PCR扩增或载体相关的错误

②双向测序。


7. 我要求5’到3’正向测序,为什么你们给我的序列是反的?

我们是按照您所选择的引物来测序的,有可能该序列与您手中资料上的序列的方向相反,也可能是目标片段的插入方向与您预期的相反。填写测序要求时,请不要使用3’引物和5’引物这样的字样,而应以T7,T3,SP6,M13f,M13r等形式来填写,或注明酶切位点方向比如“测序方向Eco RI到Hind Ⅲ”。如果您提供的载体比较特殊,还需要您提供质粒的相关图谱等资料和信息。


8. 为什么找不到我的PCR引物?

有以下几种情况,我们将无法找到PCR引物序列:

1)用PCR引物作为测序引物进行测序时,所测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的,所以找不到测序引物的序列。有两种方法可以得到测序引物序列。①对于较短的PCR产物(〈800bp),可以用另一端的引物进行测序,一直测到序列的末端,就可以在序列的末端找到您的引物的反向互补序列或是在已测出的结果200bp左右设计反向引物,也可以在序列的末端找到您的引物的反向互补序列。②对于较长的序列,一个测序反应测不到头,可以将您的PCR产物克隆到适当的载体中(比如T载体),用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与插入序列之间还有一段距离,因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出,因此,您如果想得到您的PCR产物的完整序列,最好克隆后进行测序。

2)PCR产物用T载体克隆后,由于克隆的方向是随机的,因此,当您在一条链上找不到您的引物序列时,试图在互补链上寻找您的引物序列。

3)当测序引物离您的插入片段很近时,有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为一代测序是测引物后面的序列,由于引物后面30~50个碱基测序不准确或起始端有未去除的染料或引物二聚体的干扰,造成起始区的序列不好,可能无法找到您的引物完整序列。

4)有时,质粒做模板进行测序时,由于某些原因,质粒上没有插入外源目标片段,或为空载体,所测的序列完全为载体序列,此时自然也找不到引物序列。


9. PCR测序后面很多杂信号?

PCR产物直接进行测序,序列结束后无反应信号。PCR产物测序一般末端的一个碱基为A(绿色峰),这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基,我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的,这样我们很容易辨别PCR产物结束的位点。在此序列以外就不是我们所需要的序列了。


10. 测序结果不到700bp还照常收费了,为什么?

   如果样品的DNA序列分布匀称,没有复杂结构,正常的测序反应能保证达到700bp以上。但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,测序信号突然减弱或消失,或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成。对这些结果,诺赛会根据具体情况收取费用。

出现这些情况的原因分析如下:

1)G/C rich、G/C Cluster:这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失;

2)A、T的连续结构:这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰。根据文献记载,原因在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成测序结果紊乱,出现套峰。出现这样的情况,建议反向测序;

3)原因不明的复杂结构,测序结果出现信号突然减弱或消失。这种情况一般表现为已测出部分DNA碱基排列并无特别异常,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行测序信号突然减弱或消失。


11. 我的样品你们已经测通了,但为什么在overlap区有这么多的错配,给出的全序列和单个报告也称作差异,我该相信谁?

给出的全序列是一个拼接的结果,当互相拼接的两个序列存在差异时,应该以序列质量更好为主。


12. 我的样品送测序前已经鉴定过了,有插入片段的,为什么你给我的测序结果是一个空质粒?

鉴定过程中出现的假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR和酶切两种方式鉴定。由于PCR反应受多种条件的影响,在鉴定过程中易产生假阳性,而酶切鉴定是比较可靠的鉴定方式。


13.测序完成后,测序样品和引物将如何处理(或保存)?

客户需要将测序样品或引物(客户自带的)返还时,我们在测序完成的同时,按客户要求返还样品或引物(客户自带的)。对于未要求返回的测序样品及随工引物,如无特殊要求,公司负责保存3个月(菌类样品保存1个月),我们将不再通知到期直接销毁,如后续仍需安排实验,请重新提供。


14.测序结果可以用哪些软件打开?

1)ab1格式的峰图打开软件有Sequence Scanner、DNASTAR、FinchTV、Chromas…;seq格式的序列软件除了以上的之外还可以直接用文本格式的记事本直接打开;

2)序列拼接软件Seqman、ContigExpress…

常见问题及解答

诺赛基因DNA测序登记单

诺赛基因96DNA测序登记单

诺赛基因通用引物表

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